Objectif

Il s’agira de comparer par analyse RNA seq les réponses de la vigne inoculée au niveau du tronc par un des agents pathogènes suivant : P. chlamydospora (impliqué dans l’esca), Neofusicoccum parvum (impliqué dans le BDA), E. lata (agent responsable de l’eutypiose) lorsque la rhizosphère des plants est colonisée ou non par P. oligandrum.

Méthodologie

Une thèse débutée en décembre 2012, donc parallèle à la présente demande de financement, possède un volet portant sur la protection induite par P. oligandrum contre les 3 pathogènes cités ci-avant. Une expérimentation identique à celles mises en oeuvre en 2010 et 2011 (cf. partie 2 avec P. chlamydospora) est en cours d'établissement avec N. parvum et E. lata. Les échantillons des 3 années seront mis à profit dans des analyses par micro-arrays et RNAseq (séquençage global des mRNA présents dans l'interaction plante/pathogène). L'avantage de la technologie RNAseq réside dans la possibilité d'obtenir une meilleure résolution quant aux molécules issues de la vigne (épissage alternatif des mRNA, séquences additionnelles par ex : miRNA impliqués dans l'interaction) ainsi qu'un accès aux molécules issues des pathogènes (effecteurs et autres).

Cette technologie apportera des informations moléculaires sur les gènes de la vigne induits par la présence du pathogène ainsi que sur l'état physiologique du champignon infestant (P. chlamydospora, N. parvum, E. lata). Des séquences spécifiques du champignon seront alors obtenues, ce qui aidera dans l'exploration moléculaire de la relation plante-pathogène-agent de biocontrôle par une approche double, d'une part vis à vis de la plante et d'autre part vis à vis du champignon, ce qui est actuellement limité du fait de la rareté des données moléculaires sur les champignons impliqués dans les maladies du bois de la vigne. Ce problème va être résolu via une collaboration avec des chercheurs (K. Baumgartner) de l'USDA/Université de Californie (Davis, USA) qui va permettre à court terme de bénéficier des génomes des 3 pathogènes utilisés. En effet, il sera important dans les étapes d'analyse des données RNAseq de pouvoir comparer les espèces mRNA séquencées d'une part au génome de la vigne (disponible depuis 2007) et d'autre part aux génomes des pathogènes (en cours de séquençage). Du fait de l'importance de cet aspect dans l'analyse de nos données RNAseq, le présent programme de recherche pourra éventuellement inclure une participation à l'annotation des génomes fongiques.

Le RNAseq sera réalisé à la plateforme de séquençage de Toulouse utilisant la technologie MiSeq d'Illumina (dernier type de séquenceur acquis par cette plateforme de séquençage). Cette nouvelle technologie permettra d'obtenir des séquences d'environ 200 bases. L'utilisation de ces technologies moléculaires nécessite une partie importante d'analyse bioinformatique en lien direct avec la plateforme séquençage de Toulouse.

Mise au point de l'expérimentation

Une étape préalable à l'utilisation de cette technologie RNAseq réside dans une quantification relative des mRNA issus du champignon pathogène au sein de la population totale mRNA extraite des échantillons de bois inoculés par le pathogène. Cette étape se fera par amplification en qRT-PCR sur les échantillons qui seront soumis à RNAseq.

Les bases de données moléculaires (ncbi, EBI) possèdent quelques séquences dont :

• le transcrit des gènes tubuline et MoxY (steroid monoxygenase) pour P. chlamydospora,
• le transcrit des gènes tubuline et GAPDH pour N. parvum,
• les transcrits des gènes tubuline et GAPDH pour E. lata (les séquences d'E. lata ont été déposées dans les banques publiques par nos collaborateurs de l'UC Davis).